プロトコール（すこしずつ準備中。間違っていたらごめんなさい。間違いの指摘や不明点は丹羽まで）
自分でやってみてうまくいったものだけアップロードしてあります。タイトルをクリックするとpdfファイルをダウンロードできます。日本語化して、手持ちの機器に合わせて最適化してあります。大元も読んでおくとよいと思います。
1.チューブリンの精製
Castoldi and Popov(2003)を大型超遠心器なしでできるように改変してあります。
2.チューブリンの蛍光標識方法
Alexaなどの蛍光色素で精製したtubulinをラベリングするプロトコルです。今のところAFDyeが一番いい気がしています。
3.蛍光微小管の重合
キネシンのgliding assayやTIRFによる1分子アッセイのレールのための微小管を重合する方法です。
1.TCE staining法
精製後のタンパク質をSDS-PAGE後に蛍光で検出する方法。CBB染色の代わり。廃液が少なくて済むのでGelDocなどが使えるなら便利です。
1. TIRFを用いたモータータンパク質の1分子レベルの運動解析
PLL-PEG-biotinを用いることでガラスのシラン化の手間を省くことができます。
2. TIRFを用いた微小管動態の観察 (Taguchi et al., 2022)
1分子解析の応用でこんなこともできます。
3.TIRFを用いたCAMSAPからの微小管重合（Imasaki et al., 2022)
biotin化した抗体やタンパク質をガラス表面に貼り付ければこんな応用も効きます。
1. ハイブリドーマからのIgGのcDNAのクローニング
学部生向けの分子遺伝学の講義で抗体遺伝子やリコンビナント抗体について教えているので、 勉強も兼ねて昔からよく使われているキネシン重鎖の抗体H2のハイブリドーマの免疫グロブリン遺伝子の配列を決めてみました。
「誰でも使えるようになるといいな」と思ったので、ついでにリコンビナントH2のプラスミドとscFvを作って、addgeneに預けてあります(Niwa and Chiba, Biorxiv、2022)。
講義で「海外から細胞を送るのは大変だし、ハイブリドーマが死滅したということもあるのでcDNAを決めておくのはメリット」という話をしてましたが、 ハイブリドーマを海外のラボから送ってもらうのは結構大ごとになる＆長期間にわたってハイブリドーマを液体窒素に入れておいたら起きなくなった というのを実際に体験することになりました。
scFvを作るために配列を決めたい場合は書いてあるとおりやればできると思います。手伝うこともできます（そのときのラボの体制にもよるので相談してください）。
